Mikroskopie rozlišení, zvětšení, atd.

21 Jun 12:38 pm


Original: http://www.physics.emory.edu/~weeks/confocal/resolution.html

Nejprve uvažujme ideální objekt: fluorescenční atom, něco velmi malý, ale velmi jasná. I když to je velmi malý, je to vidět. Dalo by se dokonce vidět s pouhým okem, jestli je to dost jasné. Takže problém není o tom, že “vidět” něco – je to více o tom mohli vidět, kde je a rozlišovat mezi blízké objekty.
Uvažujme ideální fluorescenční atom. Obraz tohoto atomu v mikroskopu (konfokální nebo pravidelné optický mikroskop) je místo, technicky, Airy disk, který vypadá jako na obrázku vpravo. To je z důvodu, aby difrakční efekty.

Velikost bodu se vztahuje k rozlišení. Rozlišení je schopen rozeznat rozdíl mezi dvěma blízko umístěnými jasných objektů, a jeden velký objekt,. Pokud se dva objekty jsou blíže u sebe, než vaše usnesení, pak se rozmazání společně v mikroskopu obraz a to je nemožné říci, že se jedná o dva body (možná s výjimkou Kombinovaný snímek je dvakrát tak jasná jako jeden objekt, ale stále nemůžete měřit jejich oddělení). Nejlepší řešení pro optickým mikroskopem je asi 0,2 mikronu = 200 nm.

Dobrou zprávou je, že existuje rozdíl mezi rozlišením a “schopnost lokalizovat pozici”.

Pokud máte jeden malý a izolované fluorescenční objekt, můžete často najít pozici tohoto objektu lepší než rozlišení. Obraz objektu se zobrazí jako delší blob, a můžete najít “těžiště” tohoto blob tvaru obrazu. Pokud klubíčko N pixelů a každý pixel je M mikronů napříč, můžete odhadnout střed blob asi M / N přesnost, které často bije optické rozlišení. To je užitečné, trik, ale neřeší stejný problém jako rozlišení. V některých případech můžete dělat různé triky, aby se velikost místa větší (zvýšení N), takže si můžete najít střed ještě lepší. Různé pokusy Slyšel jsem, že jste prohlašoval, že je schopný lokalizovat středy skvrny během 10-30 nm tento druh metody. Možná vás bude zajímat v některých dostupného softwaru pro identifikaci částic pozice, která implementuje toto centrum-of-masové metody.

Zvětšení je úplně něco jiného. K dispozici je technická definice, která srovnává zdánlivou úhlovou velikost obrazu, skutečné úhlové velikosti objektu, jak se zdá, kdyby to bylo 25 cm od oka. To je poněkud Programovatelné definice a podle mého názoru je relevantní hlavně pro navrhování problémy, když se učím optiku ve svých úvodních fyzikálních tříd. V reálném životě se často fotografuje pomocí CCD kamery pod mikroskopem, a projektuje je na monitoru. Použití většího monitoru určitě zvětšit obrázek další. Ale bude to ještě bude stejně rozmazané nebo ostré jako rozlišení.

Naštěstí obecně vyšší zvětšení čočky mají také lepší rozlišení. V naší laboratoři objektiv 10x má rozlišení 0,7 mikronů a objektiv 100x má rozlišení 0,2 mikronu. Jedním z dalších kompromis, aby zvážila: vyšší zvětšení čočky podívat na menších zorném poli, v poměru k jejich zvětšení. 100x cíl, který vidí zorné pole 100 x 100 mikronů ^ 2 může být porovnáno s 10násobným cílem při pohledu na 1000 x 1000 mikronů ^ 2 zorného pole.

Takže, když starosti o tom, jak dobrý je mikroskop, nejdůležitější otázka je, co je rozlišení. A v některých vědeckých aplikací (např. mé práci), které velmi záleží na tom, jak dobře můžete vyhledat středy objektů, a doufejme, že můžete porazit rozlišení. Zvětšení je mnohem méně užitečné specifikace (podle mého názoru).

Technická poznámka

Více technicky, je mikroskopickým objektivem Usnesení kvantifikovat numerickou aperturou. Tato stránka má velkou popis tohoto, stejně jako hlubší diskuse o rozlišení. Budu zde poznamenat, že vlnová délka světla použít je rozdíl, Kratší vlnové délky zlepšení rozlišení.

Comments are closed