Gelová elektroforéza

08 Jul 10:54 am


Original: http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/gellab2.html

Úvod do SDS-PAGE

Tento materiál je doprovázena prezentací o struktury proteinů a zásady za denaturaci vzorků a diskontinuální elektroforéza.

Separace makromolekul v elektrickém poli se nazývá elektroforéza. Velmi časté metoda pro separaci proteinů pomocí elektroforézy používá přerušovaný polyakrylamidovém gelu jako nosné médium a dodecyl sulfátu sodného (SDS), aby došlo k denaturaci proteinů. Metoda se nazývá sodium dodecyl sulfát polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE). Nejčastěji používaným systémem je také nazýván Laemmli metoda po Velké Británii Laemmliho, kdo byl první, kdo se zveřejní dokument využívající SDS-PAGE na vědecké studie.

SDS (tzv. lauryl sulfát) je aniontový detergent, což znamená, že po rozpuštění její molekuly mají čistý negativní náboj v širokém rozmezí pH. Polypeptidový řetězec se váže množství SDS v poměru k jeho relativní molecuar hmotnosti. Záporných SDS zničit většinu komplexní struktury proteinů, a jsou silně přitahovány směrem k anodě (kladně nabitá elektroda) v elektrickém poli.

Polyakrylamidovém gelu bránit větší molekuly z migraci tak rychle, jak menší molekuly. Vzhledem k tomu, náboje ke hmotnostní poměr je téměř stejná u SDS-denaturovaného polypeptidů, konečná separace proteinů závisí téměř úplně na rozdíly v relativní molekulové hmotnosti polypeptidu. V gelu stejnoměrné hustotě relativní vzdálenost migrace proteinu (Rf, f jako dolní index) je negativně úměrná protokolu jeho hmotnosti. Pokud bílkoviny známé hmotnosti jsou provozovány současně s neznámými, vztah mezi RF a hmotnost se vynese jako křivka a masy neznámých proteinů odhadnout.

Separace proteinů pomocí SDS-PAGE může být použita pro odhad relativní molekulovou hmotností, pro určení relativní množství hlavních proteinů ve vzorku, a rozhodnout o rozdělení proteinů mezi frakcí. Čistota vzorků proteinů může být posouzena a průběh frakcionace nebo čištění postup lze použít. Různé metody barvení mohou být použity k detekci vzácných proteinů a dozvědět se něco o jejich biochemických vlastností. Specielní techniky, jako je Western blot, dvojrozměrné elektroforézy, a mapování peptidů mohou být použity k detekci velmi omezené genových produktů, najít podobnosti mezi nimi, a pro detekci a samostatné izoenzymy proteinů.
Molekulová hmotnost ve srovnání s molekulovou hmotností

Molekulová hmotnost (symbol m) se vyjadřuje v kDa (Da). Jeden Dalton je definována jako 1/12 hmotnosti uhlíku 12C. Většina makromolekuly jsou dostatečně velké, aby použít kilodalton (kDa) popsat molekulární hmotnosti. Molekulová hmotnost není stejný jako molekulové hmotnosti. To je také známé jako relativní molekulové hmotnosti (Mr symbol, kde r je index). Molekulová hmotnost je definována jako poměr hmotnosti makromolekuly až 1/12 množství 12 atomu uhlíku. Je to bezrozměrná množství.

Když se v literatuře uvádí hmotnost v Da nebo kDa se vztahuje k molekulové hmotnosti. To je nesprávné vyjádření molekulovou hmotnost (relativní molekulová hmotnost) v daltonů. Přesto najdete termín molekulové hmotnosti použít s daltonů nebo kilodaltons v nějaké literatuře, často používat zkratku MW pro molekulové hmotnosti.

Polyakrylamidovém gelu pro SDS-PAGE

Mnoho systémů pro elektroforézu bílkoviny byly vyvinuty a zařízení používané pro SDS-PAGE se velmi liší. Metodika použitá na těchto stránkách využívá Laemmliho metody. Odkaz na způsobu Laemmliho v materiálech a metodách sekce eliminuje potřebu popsat vyrovnávací paměti, odlévání gely, přístrojů atd. Pokud se papír používá některé změny metody, že pouze údaje o SDS-PAGE by měly být uvedeny v metody sekce jsou procenta celkového akrylamidu (% T) v gelu, relativní podíl a typ síťovadla (% C), a možná i odkaz na gelu rozměrů. Používáme “mini-gel” systém s 3 1/4 “x 4” gelové kazety.

SDS-PAGE mohou být prováděny na prefabrikovaných gelů, což šetří námahu a nebezpečí práce s akrylamidu. Následující popis se vztahuje na obchod vyrobené odléváním a provozování zařízení, které jsou mnohem levnější než komerčně dostupné zařízení. Vedle nákladové účinnosti, výhodou tvorby vlastních gely poprvé je hlubší porozumění procesu.

Bez ohledu na systém, příprava vyžaduje osazení dvou různých vrstev akrylamidu mezi skleněnými deskami. Spodní vrstva (oddělování, nebo řešení, gel) je zodpovědný za skutečně oddělování polypeptidy podle velikosti. Horní vrstva (stohování gelu) obsahuje ukázkové studny. Je navržen tak, aby smést proteiny ve vzorku mezi dvěma pohyblivými stěnami tak, aby byly komprimovány (na sobě) do vrstev mikrometrů tenké, když dosáhnou separačním gelem.

 

Příprava SDS gely

Gel daného akrylamidu koncentrace proteinů účinně odděluje v charakteristickém rozsahu. Velmi velké polypeptidy nemůže proniknout hluboko do gelu, a tím i na jejich odpovídající skupiny mohou být příliš stlačen za účelem vyřešení. Polypeptidy nižší, než je velikost particluar nejsou omezeny na všechny z gelu, a to bez ohledu na množství, které všechny pohybují stejnou rychlostí společně s sledování barviva. Gel koncentrace (% T), by měla být zvolena tak, aby se proteiny zájmu jsou vyřešeny.

Typický gel o 7% akrylamidu složení vkusně odděluje polypeptidy s molekulovou hmotností mezi 45 a 200 kDa. Polypeptidy pod cut-off 45 kDa asi nevyřeší. Hustší gel, řekněme 14% T, obvykle řeší všechny z nejmenších polypeptidů v kombinaci. Takový gel by bylo zapotřebí vyřešit hemoglobin, například. Bylo by zbytečné pro řešení kapely hodně nad 60 kDa, ačkoli. Pro analýzu celého profilu zlomku, který obsahuje těžké a lehké polypeptidy, jeden by měl obvykle běží dva gely.

V učitelské laboratoři doporučujeme alternativní týmy se připravují nízké nebo vysoké procento gely, přičemž každý tým výměnu vzorků s týmem, který připravoval jiný typ gelu. Každý tým, pak by se načíst svoji sadu vzorků, příslušných norem a další týmu vzorků na jeho gelu, a mít jeho vzorky naloženo na jiný procent gelu stejně. Kromě rozšíření rozsahu rozlišení kapel, tato praxe umožňuje srovnání mezi identickými frakcí připravených různými týmy, řídit nekonzistence v frakcionaci, příprava vzorků, atd.
Kazety
Existuje mnoho systémů pro vytvoření gelové kazety, z nichž některé jsou velmi drahé. Jednoduchý “mini-deska” gel systém lze dát dohromady překvapivě malé množství peněz a dělá svou práci velmi dobře. Náš vzdělávací program je dobře pomocí projektoru brýle krytem (Kodak kočka. # 140 2130), jak kazetových desek s licí stojan, provoz stánků, hřebeny a rozpěrky dodané Crafting Sam Lee zvyk, PO Box 130973, Houston, Texas 77219, tel.. # 713-861-4636). Zde uvedený postup používá tento systém.

Používáme lití stojany na přípravu mini-desek gely. Dvě čisté desky s dvěma distančními teflonu udělat jednu kazetu. My zásobníku kazety ve vzpřímené poloze stojanu s dna zásobníků těsně u spodní části stojanu, pomocí modelovací hmota k utěsnění silný akrylové na svém místě proti poslednímu kazety, aby se vodotěsné komory. Pomocí dobře dříve (hřeben) jako šablony se nám podařilo vytvořit značku pro naplnění o centimetr pod dolní části hřebene na výšku prvního (oddělení) gelový roztok.

 

Poznámky k přípravě kazety

Zkosení nejsou nezbytné, ale pomoc při vložení plástů, když se nalije roztok stohování.
Distanční vložky může být straighted tenkou špachtlí po montáži.
Stojan musí být ve svislé poloze, jinak může docházet k úniku pravděpodobné.
Vzduchové mezery mezi hlínou a přední kryt bude mít za následek netěsnosti.
Vzhledem k tomu, akrylamid je toxický, stojan je umístěn v zásobníku, nebo na filtrační papír před nalitím gelové směsi, omezit netěsnosti.

Separační gel Příprava

Celkový objem mezi deskami našich gelových kazet je deset mililitrů, takže pokud připravujeme 10ml separačním gelem mix za kazetě máme víc než dost. My obvykle připravit tři kazety na stojanu a používat nejlepší ze tří. Z 30% akrylamidu skladem (viz poznámky níže) připravujeme gely složení 7-15% akrylamidu, v závislosti na rozsahu proteinů, které chceme oddělit. Naše oddělení gel mezisklad (4x koncentrovaný) se skládá z 0,4% SDS, 1,5 M Tris-Cl, pH 8,8. Na kazetě, smícháme 2,5 ml pufru a dostatečné zásoby akrylamidu zásob tak, aby, je-li směs přivedl na konečný objem destilovanou vodou máme požadovanou procent monomeru akrylamidu.

Akrylamid polymeruje spontánně v nepřítomnosti kyslíku, takže polymerace zahrnuje úplné odstranění kyslíku z roztoku. Polymerace je uniformní, pokud je směs odplyněna odstranit velkou část rozpuštěného kyslíku, jejich umístěním ve vakuu po dobu 5 minut nebo tak před polymerací. My initiatiate polymeraci přidáním čerstvě prepared10% peroxodisíranu amonného (AP), do této směsi a následně N, N, N ‘, N’-tetramethylethylendiamin (TEMED). Částky každé závisí na kvalitě použitého akrylamidu, a měla by být stanovena předem pokusů a omylů. My obvykle začínají s 100 ul AP a 10 ml TEMED na 10 ml směsí gelu a uvidíte, jak to chodí. Jakmile katalyzátory jsou přidány, může dojít k polymerizaci rychle, a proto je nutné, aby obsazení postavit kompletně připravený a mít překrytí roztok připraven jít (viz níže). Po vířící míchat, jednoduše nalijte roztok do prostor obsazený kazet. Kazety se sama nakonec úrovni, ale vyrovnání může být spěchal přidáním roztoku do vybraného kazetami s pipetou Pasteur. Přebytečný roztok lze odstranit tím, že nakloní přístroj a vytažením přebytek s pipetou, aby konečná výše je na plnicí značky.

Ihned po nalití na gelové směsi, musí být pokryt vodou nasyceným butanolem na další výšce 0,5 cm, tak (butanol je horní vrstva na skladě obalu). Přidání butanol na jednu kazetu se budou řídit akrylamidu mix dolů, zvyšovat úroveň ostatních, tak musí dbát na distribuci butanol rovným dílem mezi kazetami. Účelem je butanolu a vytvářejí hladký, zcela rovný povrch na horní straně se separačním gelem, aby se skupiny jsou rovné a jednotné. Butanol má velmi málo vody v roztoku a vytvoří úhlednou vrstvu na vrcholu, což je důvod, proč jsme ji používat. Voda by účinně překrytí ale bude míchat s akrylamidu řešení ředění. Ve skutečnosti, je butanol používáme nasytí vodou tak, aby se nevyschne gelové směsi.

Polymerace může být potvrzena tahem některé zbývající gel směsi do pipety, což umožňuje, aby bylo zachováno, a kontrola je po 10 minutách nebo tak. Kdy gel mix již vyloučen mačkání žárovky je nastaven dělicí gel. To by nemělo trvat déle než 15 minut pro některý z gelu se mísí polymerovat. Pokud není rosolovité do té doby, co je asi špatně. Často se poprvé “gel tvůrci” se mylně domnívat, gel nebyl polymeruje, protože horní 0,5 ml nebo tak gelové směsi nenastaví (některé kyslík se dostane přes překrytí).

Stacking gel přípravu

Deset ml stohování gel směs je dostačující pro tři z našich kazet, ale z důvodu přesnosti, může být výhodné, aby se 20 nebo 30 ml. Přebytek lze opláchnout a hodil do odpadkového koše po polymeruje. Není nutné, aby odplynu stohování mix, protože zásobník je jednoduše navrženy tak, aby jako matrice, kterými vzorky projde, jak se na ně se mezi pohyblivými stěnami. Není určen pro rovnoměrné rozdělení proteinů. Naše stohování gel mezisklad se skládá z 0,5 M Tris-Cl, pH 6,8, s 0,4% SDS. Typické vozíky jsou 3-4,5% akrylamid. Používáme 4%, aby bylo možné stohování velkých bílkovin a ještě zachovat dostatečnou mechanickou pevnost, aby se dobré vzorku studny.

Před přidáním poslední dvě složky, které se spouštějí v polymeraci, by butanol se odlije dělicí gely do dřezu s tekoucí vodou, a přebytek butanol / akrylamid odstraněny z povrchu s pipetou. Používáme AP a TEMED v podobném poměru jako na separačním gelem mixu, i když někdy zvýšit množství jedné nebo obou složek, protože nižší procentní řešení akrylamid tendenci polymerovat pomaleji. Po přidání AP a TEMED okamžitě jsme víření směsi a nalijte ji do kazety na vrcholky desek. Vložíme hřebeny jeden po druhém, dávejte pozor, chytit bubliny pod zuby a nastavte, aby se jim i pokud je nezbytná, škrábání přebytečný stohování mix off později.

Poznámky k přípravě gelu

Akrylamid je toxická látka, takže buďte opatrní a používejte ochranné rukavice při manipulaci s roztoky, které obsahují to. Používejte v dobře větraném prostoru a hlásit jakékoli skvrny. Zásobní roztoky by měly být uchovávány v digestoři.
Erlenmeyerova baňka je dobrá pro míchání akrylamidu, neboť úzké hrdlo může být zátkou, aby toxické výpary z excaping. Široký dolní umožňuje velké ploše, aby se kyslík může být rychle odstraněny z roztoku, je-li umístěna ve vakuu.
Akrylamid gel akcie je označena podle akrylamidu obsah monomeru. Naše formulace používá akrylamidu zásoby 29,2% akrylamidu a 0,8% bis-akrylamidu, cross-linker (cross linking dává gel svou mechanickou stabilitu). Zásobní roztok je označen 30% T (29,2 + 0,8 = 30), 2,5% (0,8 CBIS je 2,5% z 30).

Příprava vzorků proteinů pro elektroforézu

Polypeptid je makromolekula skládající se z nonbranching sekvence aminokyselin, z nichž každý s nejbližší jedním peptidovou vazbou. Protein se skládá z jednoho nebo více polypeptidů a / nebo doplňkovou typy molekul, držených pohromadě některý z mnoha molekulárních interakcí často včetně kovalentní vazby. Taková interakce vedou k několika úrovních organizace, které nazýváme primární, sekundární, terciární a kvartérní struktury. Intaktní bílkoviny jsou notoricky obtížné oddělit reprodukovatelné. Vzory kapel se liší v závislosti na teplotě, pufr, pH, odchylky v kvalitě přípravku, atd. Chcete-li charakterizovat typ přípravy a získání předvídatelných výsledků se snažíme, aby se bílkoviny od sebe tak, že to, co nám zbylo, je jen primární struktura. Příprava vzorku někdy nedosahuje tohoto ideálu, který objevíte, jak analyzovat své výsledky.

Aminokyselinová sekvence polypeptidu, se nazývá jeho primární struktura. Interakce rozpustných proteinů s vodou vede k vodíku, který je částečně odpovědný za sekundární struktury proteinů. Sekundární struktura se odkazuje na místní struktury polypeptidového řetězce, včetně šroubovic, skládané listy, a otočení. Funkční protein má trojrozměrný změnách struktury vyplývající z vodíku, hydrofobních aminokyselin, Van der Waal síly a disulfid lepení. Trojrozměrná struktura proteinu se nazývá jeho terciární struktura.

Kvartérní struktura se týká interakce jednotlivých polypeptidových řetězců s jinými molekulami za vzniku funkčních proteinů. I když některé proteiny do skládají z jednotlivých polypeptidů, mnoho se skládají ze dvou nebo více polypeptidů, které spojuje kovalentních vazeb, a / nebo nekovalentních sil. Ve skutečnosti, mnoho přirozených (funkční) proteiny zahrnují neproteinové komponenty jako heme skupině hemoglobinu a uhlovodíkových skupin na mnoha membránou asociované proteiny.

Ukázka denaturace

Různé vzorky pufrů byly použity pro SDS-PAGE, ale všichni používají stejné zásady na denaturaci vzorků. Získáme dobré denaturaci přípravou vzorku do konečné koncentrace 2 mg / ml proteinu s 1% SDS, 10% glycerol, 10 mM Tris-Cl, pH 6,8, 1 mM ethylendiamintetraoctové kyseliny (EDTA), redukčním činidlem, jako jako dithiothreitolu (DTT), nebo 2-merkaptoethanolu a špetkou bromfenolové modři se sloužit jako sledovací barvivo (~ 0,05 mg / ml).

Připravujeme 2x koncentrát vzorku pufru se skládá z 2% SDS, 20% glycerol, 20 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2 mM ethylendiamintetraoctové kyseliny (EDTA), 160 mM dithiothreitol (DTT), a 0,1 mg / ml bromfenolové modré barvivo. Dávám přednost DTT na 2-merkaptoethanolu, protože ta druhá má mnohem silnější nepříjemný zápach a není denaturační naše krevní složky velmi dobře. Část problému je, že naše vodní lázně nedosahují bod varu a vaření může být nezbytné s 2-merkaptoethanolu. Připravili jsme všechny naše neznámých ke stejnému spojení pak 1 objemový Získaný vzorek se 1 objemový 2x vyrovnávací paměti.

Takže, co si jednotlivé složky dělat? EDTA je konzervační prostředek, který vytváří chelát dvojmocné kationty, které snižuje aktivitu proteolytických enzymů, které vyžadují, vápenaté a hořečnaté ionty jako kofaktory. Tris působí jako vyrovnávací paměť, která je velmi důležitá, protože stohování v diskontinuální elektroforéze vyžaduje zvláštní pH. Glycerol je vzorek hustší, než je vzorkovací vyrovnávací paměti, takže vzorek zůstane na dně a ne plavat ven. Barvivo umožňuje vyšetřovatel sledovat průběh elektroforézy.

SDS, DTT, a teplo jsou odpovědné za skutečné denaturace vzorku. SDS rozdělí dva-a tří-dimenzionální strukturu proteinů přidáním záporný náboj na aminokyseliny. Vzhledem k tomu, jako souhlasné náboje odpuzují, bílkoviny jsou více či méně narovnal, okamžitě ztratí svou nefunkční. Některé kvartérní struktura může zůstat kvůli disulfidových vazeb (kovalentní), a vzhledem k kovalentní i nekovalentní vazby na jiné typy molekul. Mimochodem, jiný název pro udržitelný rozvoj je lauryl sulfát. Váš šampon může obsahovat lauryl sulfát – teď není, že důvěru v produkt?

Mnohé proteiny mají významné hydrofobní vlastnosti a může být být neprodyšně spojeny s jinými molekulami, jako jsou lipidy, přes hydrofobní interakce. Topení vzorky na nejméně 60 ° C otřásá molekuly, což SDS vázat v hydrofobních oblastí a dokončení denaturaci.Aminokyseliny cystein obsahuje thiolovou (-SH) skupiny, která spontánně tvoří disulfidovou vazbu (-SS-), s jinou sulfhydrylovou skupinou za normálních podmínek intracelulární. Disulfid propojení je kovalentní a nenarušovalo BL. DTT je silným redukčním činidlem. Jeho specifická úloha ve vzorku denaturace je odstranit poslední kousek terciární a kvartérní struktury prostřednictvím snížení disulfidových vazeb.Většina vzorků nárazníky neodstraňujte kovalentně připojeny sacharidy nebo fosfátové skupiny, a některá sdružení s jinými typy makromolekul je obtížné narušit. Polypeptidy obsahují různé množství bazických a kyselých aminokyselin, které přidávají náboj molekuly, a jednotlivé aminokyseliny, se liší v molekulové hmotnosti, i když se mohou vázat BL se stejnou afinitou. Z tohoto důvodu, účtovat hmotnostním poměru a relativní mobility mnoha proteinů je ovlivněn i jinými faktory, než je nezbytně molekulové hmotnosti. SDS-PAGE je velmi účinné při poskytování reprodukovatelné výsledky, ale nespoléhejte na přesných hodnot pro určení MW.Částky načíst

Polyakrylamid má omezenou kapacitu pro protein. Přetížení výsledky srážek a agregace bílkovin, produkovat vyskytují pruhy a šmouhy. Nedoložení v úplné zklamání, jak by se mohlo zjistit pouze nejhojnější polypeptidů, je-li to. Cílem přípravy vzorků je, aby se proteiny v denaturačním pufru, které je činí vhodné pro elektroforézu, a pro úpravu koncentrace vzorku tak, aby se příslušné množství proteinu naloženo na gelu.

Dostáváme nejlepší výsledky, pokud naložíme 10 ul 2 mg / ml výsledné koncentrace denaturovaného proteinu na vzorek dobře. Zatímco některé z více koncentrovaných bílkovin bude přetížen, budeme detekovat kapel, které představují méně obvyklé ty. Typický mini-gel dobře drží 10 ul snadno a možná 20 ul nebo více v případě, že i přepážky jsou v dobrém stavu.

Budeme zředí všech vzorků na předem stanovenou koncentraci a množství před smísením s denaturaci vyrovnávací paměti. Efektivní laboratorní personál rozdělení odpovědností, takže zatímco gely polymerací se připravují na vzorky samy, na svazky, které jsou alespoň dvakrát minimální čas potřebný k vyplnění vzorové studny. Takoví lidé začít svou práci připravenou výpočty objemů vzorku, vody a 2x koncentrovaný vzorkový pufr, které potřebují, aby se připravit na každém ze svých vzorků pro elektroforézu.

Pro úplné denaturaci vzorků topíme je do kouřící vodní lázni po dobu nejméně 10 minut. Standardy pro stanovení molekulové hmotnosti jsou připraveny stejným způsobem. Jsou drahé, a přestože dodavatelé dávat pokyny pro míchání, je obvykle nutné testovat je a provést úpravy, než na ně spoléhají na interní kalibrací důležitého gelu. “Špinavá” vzorek (s vysokým obsahem pevných částic), musí být centrifugovány před zatížením. Nicméně, vzorky obsahující rozpustné proteiny a pouze vzorky krve z typické frakcionaci jsou tak “čisté”, že odstřeďování není nutné.

Poznámky k přípravě vzorků

Za materiálů a metod, část zkoušející uvádí obecný postup použitý pro přípravu vzorků. Je to amatérský nahlásit objemové výpočty pro každý vzorek. Tyto informace nemá žádný význam pro další vyšetřovatelů. Recenzentů a / nebo editor bude trvat na odstranění této zbytečné informace.
Správné množství bílkovin načítání závisí na rozložení jednotlivých proteinů ve vzorku. Pokud je vzorek se skládá z jednoho, téměř čistý polypeptid 10 mikrogramů by obrovskou skvrnu. Pravidlem pro mini-desky gely načíst asi 0,5 mikrogramů proteinu na očekávané kapely. Vzhledem k tomu, komplexní směsi obsahují bílkoviny jsou velmi rozdílné koncentrace, není ideální jednotlivá částka načíst.
Vytápění pouze urychluje proces denaturace zvýšením molekulární pohyb. Není nutné, aby některé vzorky, ale je nutné pro membránové vzorky.
Vytápění do varu může způsobit agregaci proteinů, porážet účel SDS-PAGE. Nedostatečné vytápění můžete nechat některé proteiny neúplně denaturaci. Může požadovat pokusů a omylů k dosažení co nejlepších výsledků.
Po denaturaci lze vzorky sedět na stolní při pokojové teplotě, dokud je čas načíst. Pokud mají být uloženy na jiný den, by měly být zmrazeny.
Pokud jsou vzorky se zahřívá bez předchozího smíchání s ředícím roztokem, budou skutečně denaturované, ale ne v určené způsobem. Přemýšlejte o tom, co se stane, když si uvařit vejce.

Montáž, nakládání, a spuštění gely

Kazety je třeba opláchnout bez jakéhokoliv přebytečnou tekutinu, takže hřebeny na místě. Je-li licí stojany se používají, je jíl oškrábat čelního krytu a kryt odstraněn. Gel kazety jsou odděleny pomocí jediného hranami žiletkou v případě potřeby (s zkosené desky pomáhá). Po škrábání přebytečný gel stohování, musí být povrch desky velmi důkladně opláchnuty a vysuší, a nejlepší gely vybrána. Malé vzduchové mezery se mohou objevit mezi stohování gelu a řešení gel nebo mezi gelem a skleněných desek. Vzhledem k tomu, vnější tlak na deskách je zbaven sklo expanduje, vytváří různé mezery. Tak dlouho, dokud není spojitý kanál z horní do dolní části gelu, se na místo, které není vliv proteinu migraci.

Montáž stojanu gelu běžící se liší podle typu přístroje. V horní části zásobníku musí být kontinuální s horní vyrovnávací komory a spodní musí být kontinuální s dolní komory tak, že proud bude proudit gel sám. Kazeta musí být uzavřeny na místo pomocí těsnění nebo tmel jako agarózy. Ve fakultní laboratoři je sestava nejlépe popsat tím, že prochází postupem, s použitím filmu, a / nebo s demonstrací nastavit. Naplníme horní i spodní vyrovnávací paměti jednotky s elektrodou pufru (promývacím pufru) se skládá z 25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,1% hmotnostní dodecyl sulfátu sodného (elektroda složení pufru je součástí metody Laemmliho). Nechceme úpravě pH elektrody vyrovnávací paměti. Jsme sejměte hřeben z gelu před naplněním horní vyrovnávací prostor.

Načítání gely

Hamilton stříkačky fungují dobře pro vkládání vzorků do jamek. V ideálním případě, glycerol ve vzorku způsobuje, že ke dnu úhledně na dno studny, které umožňují až 20 ul nebo i více, které mají být načtena. Pokud hřebeny nesedí dobře, nebo talíře nejsou čisté vzorek často zavěsí a my jsou omezeny na 10 l nebo tak.

Běh gely

Anoda (+ elektroda) musí být umístěn na dně komory a katodou na horní komory. Záporně nabité proteiny se bude pohybovat směrem k anodě, samozřejmě. Gely jsou obvykle běží na napětí, které se spustí sledování barviva ke dnu tak rychle, jak je to možné bez přehřívání gelů. Přehřátí může zkreslit akrylamidu nebo dokonce prasknutí talíře. Napětí má být použit, je stanovena empiricky. Vedeme naše gely na 150 voltů.

Poznámky k gelu montáž a provoz

Kritéria pro dobrou gel patří rovné podložky, nahoře, dole v separačním gelem rovnoběžné, studny, odpovídající hloubku stohování gelu.
Agarose nebude držet na mokrých površích, takže desky a přístroje musí být úplně suché, než těsnění, bubliny ve agarózy bude nakonec způsobit netěsnosti.
Agarose sám nebude mít gel v místě – kazeta musí být zajištěno na místě.
Zjistili jsme, že jízdního pruhu děliče jsou méně pravděpodobné, že bude narušena, pokud odstraníme plástů před horní komora je naplněna.
Pruhy zkreslen v případě, že vzorky sedět v jamkách příliš dlouho před spuštěním.
Gel nelze zachránit, pokud je napětí pozpátku k žádné významné dobu.
Je-li horní komory uniká, může být gel “zachránil” za podmínky, vzorky vstoupili gel – je kazeta odstraněna, všechno sušené, kazety znovu uzavřeny v place vyrovnávací paměti znovu přidali a electrophoresis obnoveno.
Přístroj by měl být umístěn v zásobníku v případě netěsnosti, a nedotkl, zatímco napětí na.

Demontáž a barvení

Když přední barvivo je téměř v dolní části gelu, že je čas pro zastavení chodu. Pro nízké procento gely s těsným barviva frontě, měla by být barvivo na pokraji vyjetí do gelu. Když procento akrylamidu je vysoká barvivo přední může být difúzní, protože barvivo není homogenní. Pokud znáte přibližnou polohu nejnižší bílkovin kapely si můžete nechat barvivo utéct. Pouze zkušenosti vám řekne, kdy je vhodné zastavit běh. Před vyjmutím gely napájení musí být vypnut a kabely odpojili (pomocí jedné ruky, aby se zabránilo vytváření obvodu).

Odstranění gel ze zásobníku je prokázat lépe, než je popsáno. Desky jsou od sebe odděleny a gel se spadl do barvicí misky obsahující deionizovanou vodu. Po opláchnutí se voda odlije a skvrny přidán. Barvení obvykle vyžaduje inkubace přes noc za míchání.

Barvení proteinů gely

Běžně používané barvení pro detekci proteinů v polyakrylamidovém gelu je 0,1% Coomassie modří v 50% methanolu, 10% ledové kyseliny octové. Okyselené methanol vysráží bílkoviny. Barvení se obvykle provádí přes noc za míchání. Neklid cirkuluje barvivo, usnadňuje pronikání a pomáhá zajistit jednotnost barvení.

Barvivo vlastně proniká celý gel, ale pouze drží trvale na bílkoviny. Přebytečná barva se vymyje do “odbarvování ‘kyselinou octovou / methanol, i míchání. Je velmi efektivní destain ve dvou krocích, počínaje 50% methanol, 10% kyselina octová po dobu 1-2 hodin, pak se pomocí 7% methanolu, 10% kyselina methanolu až do konce. První řešení zmenšuje gel, vytěsnění hodně z kapalné složky, a gel se zvětší a vymaže v druhém roztoku. Správně mořené / destained gely by měl zobrazit vzor modrých proteinových pásem proti jasné pozadí. Gely lze sušit dolů nebo fotografoval pro pozdější analýzu a dokumentaci.

Původní barva přední, který se skládá z bromfenolové modrého barviva, zmizí během procesu. Ve skutečnosti, bromfenolu modrá je pH indikátor, který ukazuje světle žlutá v kyselém prostředí, před byly vymyty. Na nízký podíl gelu, může být dostačující protein běžet s barvivem tak, aby se přední poloha bromfenolové modři přední trvale označeny nevyřešených proteinů, často tvoří souvislý “přední”, přes spodní části gelu. Ve vyšších% gelu, je zřetelný barvivo přední obvykle získat.

Coomassie modrá skvrna nemusí některé bílkoviny, zejména ty s vysokým obsahem sacharidů. Skvrny jako pravidelné acid-Schiff (PAS), rychlý zelené, nebo Kodak “Stain je vše” může odhalit různé vzory. Silver barvení se obvykle používá při detekci velmi slabých proteinů je třeba.

Rutinní barvení s Coomasie modrý je jednoduchý – asi mála způsobů, jak zničit gel v tomto bodě jsou fyzické poškození (párání gel, například), nechal barviva bazén a sraženinu v gelu, zapomenout na alkohol u nějakého kroku, což bílkovin rozpustit a difundovat z gelu. Pokud se tak stane, dojde ke ztrátě informace.

Co bude dál?

Nyní, když máte barevné gel, co s tím dělat? V další části této studie se zaměří na gelové analýzy. Než se pustíme do detailů můžete zkontrolovat předložený materiál na samém začátku části 1, na cytoskeletu struktuře membrány savčích červených krvinek. Známá struktura je výchozím bodem pro identifikaci proteinů na gelu. Pokud jste tam byli už, pak můžete přejít do sekce gel analýzy.

Comments are closed